Institutional creator:

Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN

Contributor:

Nałęcz, Katarzyna Anna (1952- ) : Promotor

Publisher:

Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN

Place of publishing:

Warszawa

Description:

141 stron : ilustracje ; 30 cm ; Bibliografia ; Streszczenie w języku angielskim

Degree name:

doktor nauk biologicznych

Degree discipline :

nauki biologiczne

Degree grantor:

Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN ; nadanie stopnia: 2024

Type of object:

Thesis

Abstract:

ATB0,+ to transporter aminokwasów błony plazmatycznej, kodowany przez gen SLC6A14. Charakteryzuje się szeroką specyficznością substratową obejmującą wszystkie obojętne (indeks „0’’) i zasadowe (indeks „+’’) aminokwasy. Jego aktywność zależy od gradientu stężeń Na+ i Cl-. Poziom ATB0,+ (SLC6A14) jest podniesiony w wielu nowotworach, w tym w raku piersi, w których jego aktywność jest istotna dla wzrostu oraz nieograniczonej proliferacji komórek. SLC6A14 jest idealnym kandydatem w celowanych terapiach nowotworowych, ponieważ, oprócz wymienionych aminokwasów, transportuje prekursory leków i leki pochodzenia aminokwasowego, takie jak walacyklowir i walgancyklowir. Wcześniejsza analiza proteomu SLC6A14 wykryła m. in. kilka białek szoku cieplnego, w tym HSP70 (HSPA14) i HSP90-beta. W niniejszej rozprawie skupiono się na weryfikacji oddziaływania między transporterem a białkami HSP w procesie wychodzenia SLC6A14 z siateczki śródplazmatycznej. Interakcję transportera, po nadekspresji w komórkach HEK293, z białkami szoku cieplnego potwierdzono w eksperymentach immunoprecypitacji i immunofluorescencji a bezpośrednie oddziaływanie tych białek wykazano w teście ligacji zbliżeniowej. Lokalizację transportera na powierzchni komórki pokazano stosując biotynylację białek powierzchniowych. Traktowanie komórek inhibitorami HSP90 i HSP70 – odpowiednio radicicolem oraz VER155008, spowodowało drastyczny spadek obecności SLC6A14 w błonie plazmatycznej, co wynikało z obniżenia całkowitej ilości transportera w komórce. Możliwość interakcji między SLC6A14 a HSP90 badano mierząc aktywność ATPazy oczyszczonego, rekombinowanego białka HSP90-beta, w układzie in vitro, w obecności poszczególnych peptydów, stanowiących fragmenty wybrane z N- i C-końca transportera. Wykazano, że tylko dwa peptydy, odpowiadające fragmentom z C-końca zlokalizowanym bliżej 12 domeny transbłonowej SLC6A14, wpływały na tę aktywność chociaż w przeciwny sposób. Wyniki wskazują na zaangażowanie C-końcowego fragmentu, który jest istotny dla wychodzenia SLC6A14 z siateczki śródplazmatycznej poprzez wiązanie SEC24C, także w zmianę aktywności HSP90-beta, co sugeruje że ten sam fragment transportera wiąże zarówno HSP90- beta jak i SEC24C i jest odpowiedzialny za prawidłowe fałdowanie SLC6A14 i jego dalszy transport do błony plazmatycznej. Z uwagi na to, że wysoką ekspresję zarówno SLC6A14, jak i HSP90-beta zaobserwowano w różnych typach nowotworów postanowiono sprawdzić, czy HSP90-beta mógłby pełnić rolę regulatora aktywności endogennego SLC6A14 w liniach komórkowych raka piersi. Badania przeprowadzono na liniach nowotworowych z obecnym receptorem estrogenowym oraz kontrolnej linii nabłonkowej. Bezpośrednie oddziaływanie SLC6A14 z HSP90-beta potwierdzono w teście ligacji zbliżeniowej we wszystkich wybranych liniach, jednak na znacznie wyższym poziomie w liniach nowotworowych, w porównaniu z kontrolną. Wychwyt radioaktywnej leucyny, substratu SLC6A14 o wysokim powinowactwie, był wyraźnie zmniejszony po traktowaniu inhibitorem HSP90-beta, w komórkach raka piersi z obecnym receptorem estrogenowym (ER-α+). W nienowotworowej linii komórkowej MCF 10A nie obserwowano wpływu inhibitora HSP90 na akumulację leucyny, w obecności jonów chloru, a akumulacja leucyny była znacznie niższa niż w liniach raka piersi. Radicicol istotnie zmniejszał jednak interakcję między SLC6A14 i HSP90-beta, co sugeruje, że synteza transportera jest niższa w komórkach nienowotworowych i znacznie wyższa w komórkach nowotworowych, a to wskazuje na zaangażowanie HSP w regulacje aktywności SLC6A14. Ponadto test przeżywalności wykazał zwiększoną śmiertelność komórek, po traktowaniu inhibitorami, α-metylotryptofanem (SLC6A14) i radicicolem (HSP90), podawanymi osobno a skojarzenie tych związków istotnie wzmocniło ten efekt. Obserwacja, że α-metylotryptofan i radicicol w niskim stężeniu wywołują synergistyczny efekt cytotoksyczny w liniach komórkowych raka piersi, może stanowić potencjalną strategię w terapii skojarzonej

Detailed Resource Type:

Praca doktorska

Resource Identifier:

oai:rcin.org.pl:243071

Source:

IBD PAN, sygn. 20573 ; click here to follow the link

Language:

pol

Language of abstract:

eng

Rights:

Prawa zastrzeżone - dostęp nieograniczony

Terms of use:

Zasób chroniony prawem autorskim. Korzystanie dozwolone w zakresie określonym przez przepisy o dozwolonym użytku.

Copyright holder:

Zgoda na udostępnienie pracy w formie cyfrowej wyrażona oświadczeniem autora

Digitizing institution:

Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego Polskiej Akademii Nauk

Original in:

Biblioteka Instytutu Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN

Access:

Otwarty