Mechanizm przesuwania dwóch mikrotubul względem siebie przez kinezynę-1 oraz znaczenie wybranych modyfikacji potranslacyjnych tubuliny w tym procesie : praca doktorska

Kliszcz, Beata

Mechanizm przesuwania dwóch mikrotubul względem siebie przez kinezynę-1 oraz znaczenie wybranych modyfikacji potranslacyjnych tubuliny w tym procesie : praca doktorska

Pobierz

Opis
Informacje

Tytuł: Mechanizm przesuwania dwóch mikrotubul względem siebie przez kinezynę-1 oraz znaczenie wybranych modyfikacji potranslacyjnych tubuliny w tym procesie : praca doktorska

Abstrakt:

Kinezyna-1 jest białkiem motorycznym (motorem molekularnym), który przekształca energię pochodzącą z hydrolizy ATP w ruch mechaniczny. Motor ten „kroczy” po mikrotubuli (MT) w stronę jej końca plus. Kinezyna-1 jest heterotetramerem złożonym z dwóch łańcuchów ciężkich i dwóch lekkich. Główną rolą kinezyny-1 w komórkach jest transport różnych ładunków od ciała komórki do jej dystalnych części oraz reorganizacja struktury cytoszkieletu mikrotubularnego.Każdy z dwóch łańcuchów ciężkich kinezyny-1 zawiera dwa miejsca wiązania MT – jedno w domenie motorycznej, którego powinowactwo do MT zależy od obecności ATP, oraz drugie w ogonie, niezależne od ATP. Dzięki temu kinezyna-1 może jednocześnie oddziaływać z dwiema MT, czyli sieciować je albo przesuwać względem siebie, co określa się jako sliding. W neuronie ten proces jest niezbędny podczas powstawania aksonu – nacisk mechaniczny na błonę komórkową zapoczątkowuje i ukierunkowuje tworzenie wypustki. Jednakże, nadal niewiele wiadomo jaki jest mechanizm przesuwania dwóch MT przez kinezynę-1, wzajemna orientacja MT podczas ruchu, sposób wiązania się cząsteczek kinezyny między MT, a także jaka jest regulacja wymienionych procesów.W celu zbadania mechanizmu przesuwania jednej MT względem drugiej przez kinezynę-1, najpierw opracowano nowy test ruchliwości in vitro. Badana była rekombinowana dimeryczna kinezyna-1 pełnej długości bez łańcuchów lekkich. Do tego białka, jak również do MT zostały dołączone znaczniki fluorescencyjne umożliwiające ich indywidualną obserwację. Całość była wizualizowana przy pomocy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). Umożliwiło to jednoczesną obserwację kinezyny jak również MT transportowanej i stacjonarnej, które zawierały różne proporcje znacznika fluorescencyjnego w celu ich rozróżnienia.Analiza filmów otrzymanych z użyciem tego zestawu badawczego wykazała, że średnia szybkość przesuwania MT względem siebie (120 nm/s) jest dużo niższa niż procesywne kroczenie pojedynczych cząsteczek (600 nm/s) lub zbiorowe przesuwanie MT po powierzchni pokrytej kinezynami (gliding) (1200 nm/s). W przeciwieństwie do dwóch pozostałych analiz, ruch MT-MT nie był płynny, pojawiały się okresy dużego spowolnienia, jak również częstokroć występowały znaczące przerwy w ruchu. W doświadczeniach z polarnie znakowanymi MT wykazano, że wystąpiły 3 konfiguracje MT transportowych i stacjonarnych: przesuwanie antyrównoległych MT do końca plus, równoległych do końca minus oraz równoległych do końca plus MT. Nieoczekiwanie wykazano, że przesuwane są nie tylko antyrównoległe MT, jak to obserwowano dla innych białek motorycznych, ale również równoległe MT, co zgodnie z proponowanym w pracy mechanizmem jest skutkiem procesywnej generacji ruchu przez kinezynę-1.Kinezyna-1 może ulegać autoinhibicji – zmianie konformacji, uniemożliwiającej ruch, co mogło utrudniać powtarzalną obserwację procesu przesuwania dwóch MT. Aby wyeliminować elastyczny fragment kinezyny niezbędny do autoinhibicji (zawias-2,505-610), przy użyciu narzędzi biologii molekularnej utworzono konstrukt z delecją obejmujący zawias-2. Okazało się, że taka kinezyna 6 razy rzadziej przesuwała MT względem siebie, a w przypadkach, kiedy taki ruch wystąpił, jego długość przebiegu była 5 razy niższa niż w przypadku kinezyny-1 typu dzikiego. Zatem obecność elastycznego fragmentu jest konieczna, aby kompensować brak synchronizacji cząsteczek kinezyny-1 transportujących tę samą MT.Zbadano też wpływ modyfikacji potranslacyjnych tubuliny na przesuwanie MT względem siebie przez kinezynę-1. Wykazano, że w przypadku mikrotubul detyrozynowanych czas ruchu mikrotubula-mikrotubula jest dłuższy niż dla tyrozynowanych, a w przypadku glutamylacji zaobserwowano niższy procentowy udział przerw niż dla kontroli. Z kolei analiza szybkości oraz odległości transportu nie wykazała znaczących różnic dla badanych modyfikacji potranslacyjnych tubuliny