Oddziaływania kanału potasowego ROMK2 z białkami mitochondrialnymi : praca doktorska

Krajewska, Milena.

Skip to main menu
Skip to search engine
Skip to content
Skip to footer

Oddziaływania kanału potasowego ROMK2 z białkami mitochondrialnymi : praca doktorska

Download

Description
Information

Title: Oddziaływania kanału potasowego ROMK2 z białkami mitochondrialnymi : praca doktorska

Abstract:

Niedotlenienie/reperfuzja serca oraz mózgu prowadzi do uszkodzenia i śmierci komórek i jest najczęstszą przyczyną zgonów w krajach rozwiniętych. Wydaje się, że kanały mitochondrialne biorą udział w cytoprotekcji w czasie reperfuzji. Jednym z nich jest mitochondrialny kanał potasowy hamowany przez ATP (mitoKATP). Zaproponowano, że ROMK2 może być podjednostką mitoKATP. ROMK2 jest izoformą białka ROMK1 tworzącego kanały potasowe w błonie komórkowej. Kanały te oddziałują z wieloma białkami uczestniczącymi w regulacji ich aktywności i transporcie w komórce. Dotychczas niezidentyfikowane zostały żadne białka oddziałujące z ROMK2 w mitochondriach. Głównym celem badań prezentowanych w tej rozprawie doktorskiej była identyfikacja białek wchodzących w skład najbliższego otoczenia kanału ROMK2. W tym celu wykorzystano metodę metody biotynylacji białek sąsiadujących. Wśród biotynylowanych białek znaleziono białka cytoplazmatyczne biorące m.in. udział w endocytozie, transporcie pęcherzykowym, stresie oksydacyjnym, syntezie nukleotydów, czy metabolizmie lipidów. Zidentyfikowano ponadto białka kompleksów translokaz uczestniczących w imporcie białek przez zewnętrzną i wewnętrzną błonę mitochondriów. Wśród podjednostek tych translokaz znaleziono kinazę acyloglicerolową (AGK), która oprócz importu politopowych białek do wewnętrznej błony mitochondrialnej uczestniczy w syntezie lipidów: kwasu lizofosfatydowego (LPA) oraz kwasu fosfatydowego (PA). Poprzez koimmunoprecypitację udowodniono istnienie kompleksu zawierającego ROMK2 i AGK. Kolejnym celem były badania nad farmakologiczną modulacją aktywności kanału ROMK2. W celu realizacji tych badań białko ROMK2-6xHis produkowano w bakteriach Escherichia coli; błony bakteryjne solubilizowano przy pomocy amfipatycznych kopolimerów, a białko kanałowe oczyszczono poprzez chromatografię metalopowinowactwa. Badania aktywności elektrycznej ROMK2-6xHis prowadzono stosując technikę planarnych dwuwarstw lipidowych. Sprawdzono wpływ znanych modulatorów kanału mitoKATP na aktywność białka ROMK2. Aktywność kanałowa ROMK2 stymulowana była przez aktywator mitoKATP diazoksyd i blokowana przez znane jego inhibitory, tj. ATP/Mg2+, 5-HD oraz glibenklamid. Wyniki te są zgodne z hipotezą, że białko ROMK2 może być podstawową jednostką budującą mitoKATP. Badania te dodatkowo wykazały, że wpływ tych modulatorów był bezpośredni, a nie związany z obecnością białek akcesoryjnych. W końcu wykazano funkcjonalną interakcję pomiędzy ROMK2, a AGK, gdyż produkty enzymatycznej aktywności białka AGK, tj. LPA i PA regulowały aktywność kanału ROMK2.