Metadata language
Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN ; Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej
Contributor:Miączyńska, Marta : Promotor ; Cendrowski, Jarosław : Promotor pomocniczy
Publisher:Nencki Institute of Experimental Biology PAS
Place of publishing: Date issued/created: Description:131 stron : ilustracje ; 30 cm ; Bibliografia ; Streszczenie w języku polskim
Degree grantor:Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN
Type of object: Subject and Keywords:ESCRT ; Lizosomy ; mTORC1 ; TFEB ; TFE3
Abstract:Endocytoza to proces pobierania cząsteczek ze środowiska zewnątrzkomórkowego lub powierzchni komórki i dostarczania ich do organelli zwanych endosomami, które pośredniczą w transporcie ładunku wewnątrz komórki. Białka obecne na błonach endosomalnych są rozpoznawane przez endosomalne kompleksy sortujące ESCRT (ang. endosomal sorting complexes required for transport), tworzone przez kompleksy ESCRT-0, -I, -II i -III. Umożliwiają one deformację zewnętrznej błony endosomalnej prowadząc do utworzenia pęcherzyków wewnętrznych w świetle endosomów, tzw. ILVs (ang. intraluminal vesicles). Zawartość ILVs może być wydzielana na zewnątrz komórki lub transportowana szlakiem endolizosomalnym do lizosomów. Dzięki aktywności hydrolaz, lizosomy dostarczają komórce składników odżywczych pochodzących z degradacji makrocząsteczek. Dodatkowo lizosomy regulują sygnalizację zależną od Ca2+, a także stanowią platformę umożliwiającą wykrywanie dostępności składników odżywczych.Mimo dobrze scharakteryzowanej roli ESCRT-I w funkcjonowaniu endosomów, udziałtego kompleksu w utrzymaniu homeostazy lizosomów pozostaje słabo zbadany. Celem rozprawy doktorskiej było scharakteryzowanie roli ESCRT-I w utrzymaniu homeostazy lizosomów, a także zbadanie konsekwencji braku ESCRT-I dla prawidłowego funkcjonowania lizosomów i sygnalizacji związanej z lizosomami.Realizując wyznaczony cel, w pierwszej kolejności scharakteryzowano morfologię lizosomów po usunięciu białek kompleksu ESCRT-I (Tsg101 i Vps28) za pośrednictwem siRNA (ang. small interfering RNA) w modelowych liniach komórkowych raka jelita grubego RKO i DLD-1. Analiza mikroskopowa znaczników lizosomalnych wykazała, że brak ESCRT- I prowadził do powstawania powiększonych lizosomów, ale nie zaburzał ich integralności, utrzymania niskiego pH i zawartości hydrolaz. Powiększenie lizosomów po usunięciu ESCRT- I mogło być spowodowane zaburzoną degradacją białek błonowych obecnych na lizosomach,m. in. kanału wapniowego MCOLN1, którego degradacja została zbadana przy użyciu linii reporterowej RKO-GFP-MCOLN1.W celu weryfikacji czy brak podjednostek ESCRT-I prowadzi do aktywacji odpowiedzi transkrypcyjnej charakterystycznej dla zaburzonej funkcji lizosomów, przeprowadzono analizę sekwencjonowania RNA. Wykazano, że brak ESCRT-I indukował ekspresję genów związanych z autofagią i/lub biogenezą lizosomów. Analiza frakcji jądrowych komórek pozbawionych ESCRT-I potwierdziła aktywację czynników transkrypcyjnych z rodziny MiT- TFE, takich jak TFEB i TFE3, potencjalnie zaangażowanych w indukcję ekspresji tych genów. Następnie zbadano mechanizm związany z aktywacją czynników MiT-TFE po usunięciu ESCRT-I. Analiza mikroskopowa wykazała, że w komórkach pozbawionych ESCRT-I aktywacja czynników TFEB i TFE3 wymagała sygnalizacji zależnej od Ca2+ i hamowania aktywności kinazy mTORC1, ale nie była spowodowana ich defosforylacją zależną od kalcyneuryny. Dodatkowo, analiza biochemiczna pokazała, że brak ESCRT-I hamował aktywność mTORC1 specyficzną względem TFEB i TFE3, lecz nie wpływał na kanoniczne substraty mTORC1. Dlatego sprawdzono czy aktywacja MiT-TFE po usunięciu ESCRT-I nastąpiła z powodu zmniejszonej aktywności kompleksu GTPazy Rag, o którym wiadomo, że kontroluje aktywność mTORC1 specyficzną dla TFEB i TFE3. Nadekspresja stale aktywowanego mutanta RagC zapobiegła translokacji TFEB i TFE3 do jądra komórkowego w komórkach pozbawionych ESCRT-I, wskazując iż aktywacja czynników MiT-TFE zachodziław wyniku hamowania szlaku mTORC1 zależnego od GTPazy Rag.Wyniki przedstawione w niniejszej rozprawie opisują nowe funkcje kompleksu ESCRT-I w degradacji lizosomalnych białek błonowych i utrzymaniu niekanonicznej sygnalizacji mTORC1. Brak ESCRT-I prowadzi do odpowiedzi homeostatycznej, polegającej na hamowaniu niekanonicznej sygnalizacji mTORC1, a w konsekwencji aktywację czynników TFEB i TFE3, by przeciwdziałać niedoborom składników odżywczych pochodzących z degradacji lizosomalnej
Resource type: Detailed Resource Type: Source:IBD PAN, sygn. 20268 ; click here to follow the link
Language: Language of abstract: Digitizing institution:Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego Polskiej Akademii Nauk
Original in:Biblioteka Instytutu Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN
Access: